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针对上述问题，山东大学仇吉川教授和刘宏教授团队联合开发了一种顺利获得顺序冷冻切片与脱细胞化制备均一胶原微纤维的简单高效方法。所制备的胶原微纤维保留了完整的周期性横纹（D周期≈67 nm）和三重螺旋结构，可与NSCs自组装形成工程化球状体，有效缓解缺氧、增强ECM-细胞相互作用并提高细胞活力。更重要的是，这些微纤维可作为分化调节剂的储库，精准引导NSCs向神经元分化，形成功能性神经微组织。该胶原微纤维工程化球状体在移植后表现出优异的存活率和神经元分化能力，显著加速SCI小鼠的运动功能恢复和组织修复。该文章于2026年1月8日以《Facile Fabrication of Uniform Collagen Micro-Fibrils for Engineering Stem Cell Spheroids and Spinal Cord Injury Repair》为题发表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202530882）。

（1）胶原微纤维的制备与表征

以牛跟腱为起始材料，利用其I型胶原纤维的有序多级结构（图1a），顺利获得垂直于纤维方向的冷冻切片（20 μm）结合脱细胞化处理，使切片自然解离为均一分散的胶原微纤维，完整保留其周期性横纹（D周期≈67 nm）和三重螺旋结构（图1c）。该方法可规模化制备（图1d：900 mL、10 mg/mL悬浮液），且微纤维在水相中稳定分散至少5天。光镜及统计分析显示微纤维分散良好、尺寸均一（长度≈20 μm，图1e、f），FITC标记进一步证实其均一性（图1g）。TEM、AFM和SEM表征显示微纤维直径100–400 nm，呈现特征性67 nm周期性横纹（图1h–j），与天然I型胶原的D周期结构一致，证实其完整保留了天然胶原的微纳结构。

图1.肌腱组织的多级结构及胶原微纤维的制备。a）肌腱多级结构示意图；b）胶原纤维多级结构示意图；c）胶原微纤维制备流程示意图；d）900 mL浓度为10 mg/mL的胶原微纤维水悬浮液数码照片；e）胶原微纤维光学显微镜图像；f）对应的长度分布统计；g）FITC标记胶原微纤维的荧光图像；h）胶原微纤维的TEM图像；i）代表性胶原微纤维的AFM图像及三维形貌图；j）代表性胶原微纤维的SEM图像。

（2）胶原微纤维与NSCs自组装形成工程化球状体及细胞存活改善

在证实胶原微纤维与NSCs良好生物相容性后，研究团队顺利获得直接自组装将其整合入NSC球状体作为ECM（图2a）。利用Aggrewell微孔板，胶原微纤维与NSCs在24小时内逐渐组装成球状体（图2b），荧光图像显示微纤维在球状体内均匀分布，形成纤维网络并与NSCs相互连接，模拟天然组织的ECM-细胞关系（图2c）。添加50和100 μg/mL胶原微纤维使球状体平均直径从133 μm分别增至151和166 μm，有效减少细胞紧密堆积。缺氧评估显示，第3天纯NSC球状体HIF-1α荧光强度为18.1%，而50和100 μg/mL组分别降至13.4%和6.2%（图2e、g）；TUNEL凋亡检测显示纯球状体TUNEL阳性细胞为21.4%，两实验组分别降至12.5%和7.5%；活/死染色进一步证实活细胞比例从68.7%提升至84.7%和90.0%（图2f、h）。上述结果表明，胶原微纤维作为ECM的整合促进了氧气运输并显著改善了球状体内NSCs的存活。

图2.胶原微纤维与NSCs自组装形成球状体及胶原微纤维作为ECM改善细胞存活。a）胶原微纤维与NSCs自组装形成工程化细胞球状体示意图；b）0–24 h组装过程明场及荧光图像；c）第1天不同浓度胶原微纤维工程化球状体荧光图像；d）胶原微纤维改善工程化球状体内缺氧示意图；e、g）第3天不同浓度胶原微纤维工程化球状体HIF-1α免疫荧光图像及荧光强度分析；f、h）第3天不同浓度胶原微纤维工程化球状体活/死染色图像及活细胞比例统计。

（3）胶原微纤维工程化球状体中增强的ECM-细胞相互作用与细胞增殖

为评估胶原微纤维对ECM-细胞相互作用的影响，研究团队检测了黏附相关蛋白表达。免疫荧光显示，第3天添加50和100 μg/mL胶原微纤维后，paxillin荧光强度从约12.3%分别增至20.5%和36.5%（图3a、b），LN表达上调2.8和3.9倍（图S8）；RT-qPCR证实两浓度组paxillin、LN和FN的mRNA水平分别上调1.5–1.9倍、1.6–1.7倍和1.7–1.8倍（图3c）。CCK-8增殖实验显示，纯NSC球状体第3天后增殖率下降，而含胶原微纤维的球状体持续快速增长至第7天，第5天时50和100 μg/mL组细胞活性分别为纯球状体的1.57和1.69倍（图3d）；EdU染色显示第3天两实验组EdU阳性细胞从39.7%分别增至58.4%和71.2%（图3e–g）。基于以上结果，后续实验选用100 μg/mL胶原微纤维组装工程化球状体。

图3.胶原微纤维增加工程化球状体中黏附相关蛋白分泌和细胞增殖。a）第3天不同浓度胶原微纤维NSC球状体paxillin免疫荧光图像；b）基于免疫荧光结果的paxillin平均荧光强度计算；c）第3天不同浓度胶原微纤维NSC球状体黏附相关基因的RT-qPCR结果；d）第1、2、3、5、7天不同浓度胶原微纤维NSC球状体增殖分析；e–g）第1、2、3天不同浓度胶原微纤维NSC球状体EdU染色图像。

（4）工程化球状体中神经元分化的增强与神经微组织构建

研究团队利用胶原微纤维作为药物储库平台，选择DAPT（γ-分泌酶抑制剂）作为模型药物，顺利获得共孵育吸附后与NSCs自组装形成DAPT-胶原纤维-NSC球状体（图4a）。¹⁹F-NMR证实DAPT成功吸附（图4b），ICG释放实验显示可持续释放超过19天（图4c）。免疫荧光显示，第7天DAPT-胶原纤维-NSC球状体Tuj1和MAP2阳性细胞比例分别为49.1%和42.8%，显著高于NSC球状体（21.3%和27.6%）和胶原纤维-NSC球状体（21.7%和28.3%），神经突更长、形态更典型；第14天两指标进一步增至59.8%和52.5%，神经元相互连接形成神经网络，GFAP阳性星形胶质细胞与神经元交织分布（图4d、e）。RT-qPCR显示第7天和第14天Tuj1、MAP2 mRNA分别上调2.3/1.4倍和2.0/2.1倍（图4f）。钙离子成像显示第14天DAPT-胶原纤维-NSC球状体在KCl刺激下出现同步钙内流，证实其形成功能性神经微组织（图4g、h）。

图4.工程化球状体中的神经元分化。a）DAPT-胶原纤维工程化球状体内NSCs向神经元分化示意图；b）DAPT、胶原微纤维及DAPT-胶原微纤维的¹⁹F-NMR光谱；c）胶原微纤维中ICG在19天内的累积释放曲线；d、e）第7天NSC球状体、胶原纤维-NSC球状体和DAPT-胶原纤维-NSC球状体组Tuj1（d）和MAP2（e）免疫荧光图像；f）第14天三组Tuj1、MAP2和GFAP的RT-qPCR结果；g、h）神经微组织内神经元去极化后细胞内钙离子荧光成像及对应荧光强度变化。

（5）SCI小鼠模型中运动功能恢复与脊髓修复的改善

研究团队将工程化球状体移植至SCI小鼠T10半切损伤部位，分为SCI组、NSC球状体组、胶原纤维-NSC球状体组和DAPT-胶原纤维-NSC球状体组。CatWalk步态分析显示，第4周DAPT-胶原纤维-NSC球状体组拖趾恢复最佳，规律性指数、摆动速度、步长、印迹宽度、最大强度和支撑基础等参数均最优（图5a、b）；BMS评分亦显示该组运动功能恢复最佳（图5c）。MEP检测显示该组峰值幅度从SCI组的0.6增至2.1，显著优于NSC球状体组（1.1）和胶原纤维-NSC球状体组（1.6）（图5d、e）。

图5. 植入胶原纤维工程化球状体后SCI小鼠的运动功能恢复。a）移植后4周各组小鼠CatWalk步态分析代表性图像；b）移植后4周各组小鼠步态参数定量分析；c）移植后不同时间点各组小鼠后肢BMS评分；d）移植后4周各组小鼠代表性MEP图像；e）基于d图的MEP峰值幅度统计分析。

研究团队使用GFP转基因NSCs追踪移植细胞命运，移植后7天，胶原纤维-NSC球状体和DAPT-胶原纤维-NSC球状体组GFP阳性细胞数分别为NSC球状体组的2.2和2.8倍（图6a、b）；DAPT-胶原纤维-NSC球状体组Tuj1⁺/GFP⁺阳性细胞为另两组的2.0倍，而GFAP⁺/GFP⁺阳性细胞仅为0.5和0.6倍，表明胶原微纤维改善了NSCs存活，DAPT修饰进一步促进其向神经元分化（图6c、d）。移植后4周，胶原纤维-NSC和DAPT-胶原纤维-NSC球状体组损伤区域Tuj1阳性神经元数量分别为NSC组的1.1和1.3倍，GFAP荧光强度降至NSC组的80%和60%，表明星形胶质细胞瘢痕减少（图6e、f）。此外，FITC标记的胶原微纤维可在28天内生物降解，主要器官未见明显炎症反应。

图6.移植胶原微纤维工程化球状体后SCI小鼠的组织修复。a）移植后1周各组脊髓组织免疫荧光图像；b–d）基于免疫荧光结果的GFP细胞计数（b）、Tuj1⁺/GFP⁺阳性细胞百分比（c）和GFAP⁺/GFP⁺阳性细胞百分比（d）统计分析；e）移植后4周各组脊髓组织Tuj1和GFAP免疫荧光图像；f）基于e图的Tuj1荧光强度定量分析。