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针对上述问题，浙江大学周民教授团队提出了创新思路，从天然螺旋藻（Spirulina platensis, SP）中提取出具有良好生物相容性的细胞外囊泡（EVs），并将强效抗氧化剂虾青素（astaxanthin, AST）负载其中，成功构建了工程化的微藻囊泡递送系统（SP-EVs@AST）。该设计既完整保留了EVs的结构与生物活性，也有效改善了AST水溶性差、稳定性不足的问题，实现了载体与药物的高效协同。实验表明，SP-EVs@AST能有效清除辐射诱导的过量活性氧（ROS），恢复线粒体功能，并显著抑制炎症因子释放，从而为细胞建立起对抗辐射损伤的有效屏障。为进一步提升疗效，研究团队将该递送系统封装于由醛基化透明质酸（HA-CHO）和羧甲基壳聚糖（CMCS）顺利获得动态共价交联形成的水凝胶网络中，开发出一种具有缓释功能的皮肤防护敷料。该敷料不仅能长期维持囊泡活性、实现药物可控释放，还在动物实验中表现出优异的放射防护效果和长期生物安全性。该文章于2025年7月22日以《Engineered Microalgal Extracellular Vesicles for Enhancing Mitochondrial Homeostasis in Radiodermatitis Prevention》为题发表于《ACS Nano》（ DOI: 10.1021/acsnano.5c07135）。

方案1. 展示 SP-EVs@AST 凝胶合成及其预防放射性皮炎功能的示意图

（1）SP-EVs@AST的制备与表征

 螺旋藻（图1a）呈三维螺旋形微米级结构（图1b-d），可作为细胞外囊泡（SP-EVs）的来源。透射电镜显示SP-EVs呈典型球形双层膜结构，平均尺寸约100 nm；负载后囊泡形态完整，尺寸与形貌未发生显著变化（图1f）。动态光散射测定表明，二者水合粒径均分布在200–300 nm范围内（图1g），且Zeta电位在负载前后保持稳定（图1h）。紫外-可见吸收光谱证实SP-EVs@AST同时具有AST与SP-EVs的特征吸收峰（图1i）。溶解度测试显示SP-EVs@AST在PBS中的溶解度较游离AST显著提高（图1j）。基于AST浓度-吸光度标准曲线，计算得到在AST/SP-EVs质量比为1:7时包封率最高，可达55%（图1k）。结果表明，SP-EVs可构建为稳定高效的AST递送平台。

图1 SP-EVs@AST的合成与表征。（a）螺旋藻的照片、（b）明场、（c）荧光及（d）SEM图像；（e）SP-EVs@AST的合成示意图；（f）SP-EVs与SP-EVs@AST的TEM图像；（g）SP-EVs与SP-EVs@AST的粒径分布；（h）凝胶、SP-EVs、AST及SP-EVs@AST的Zeta电位；（i）SP-EVs、AST及SP-EVs@AST的紫外-可见吸收光谱；（j）不同质量比负载后AST的溶解度；（k）各组负载AST后的紫外-可见吸光度值。

（2）SP-EVs@AST水凝胶的制备与表征

顺利获得希夫碱反应将醛基化透明质酸（HA-CHO）与羧甲基壳聚糖（CMCS）交联形成水凝胶，并包裹SP-EVs@AST，制得SP-EVs@AST凝胶（图2a）。粘附性测试表明，在组分浓度为5%时水凝胶表现出最佳粘附性能（图2b）。扫描电镜显示，载药水凝胶与未载药水凝胶的结构形貌相似（图2c）。流变学分析表明，SP-EVs@AST凝胶的储存模量与损耗模量在55 s处相交，表明其具有快速凝胶特性（图2d）。该凝胶可适配不同弯曲角度的指关节，并能塑造成多种形状，展现出良好的适应性（图2e）。溶胀实验显示，凝胶在生理盐水中8 h内达到溶胀平衡，结构相对稳定，抗过度溶胀能力强（图2f,g）。经PKH26标记的SP-EVs@AST在凝胶基质中均匀分散（图2h）。在模拟伤口微环境的释放实验中，酸性条件（pH 5）下凝胶因希夫碱键更易断裂而释放较快；中性与弱碱性（pH 7、8）环境下释放较为平缓，并在24 h内基本达到释放平台（图2i）。

图2 SP-EVs@AST凝胶的合成与表征。（a）凝胶的合成示意图；（b）不同浓度HA-CHO与CMCS凝胶的粘附性能；（c）空白凝胶与SP-EVs@AST凝胶的SEM图像，红色区域为局部放大；（d）HA-CHO、CMCS与SP-EVs@AST混合后水凝胶的随时间变化的模量分析；（e）SP-EVs@AST凝胶的形貌重塑与适应性；（f）SP-EVs@AST凝胶的溶胀与形态变化图像；（g）SP-EVs@AST凝胶随时间变化的溶胀率；（h）凝胶内PKH26标记的SP-EVs@AST的三维成像；（i）凝胶中SP-EVs@AST随时间释放的浓度。

（3）SP-EVs@AST水凝胶恢复细胞增殖与迁移

共聚焦显微镜观察显示，HaCaT细胞对PKH26标记的SP-EVs@AST的摄取具有时间依赖性，4 h可见明显摄取（图3a）。克隆形成实验显示该凝胶能有效保护细胞免受辐射引起的克隆形成能力丧失（图3b,c）。活死细胞染色结果显示，与IR组相比，SP-EVs@AST凝胶组与SP-EVs凝胶组的细胞存活率显著更高（图3d,e）。流式细胞术分析进一步证实，SP-EVs@AST凝胶可保护辐照细胞，降低辐射诱导的细胞凋亡（图3f,g）。划痕实验表明，经SP-EVs@AST凝胶处理的细胞在12 h后表现出更高的伤口闭合率（图3h,i）。Transwell迁移实验也证实该凝胶能有效恢复辐照后细胞的迁移能力（图3j,k）。

图3 SP-EVs@AST凝胶保护HaCaT细胞免受辐射损伤并促进细胞功能恢复。（a）HaCaT细胞对SP-EVs@AST的摄取情况（红色为PKH26标记的EVs，蓝色为DAPI）；（b）各组细胞克隆形成图像及（c）定量分析；（d）各组细胞活死染色荧光图像（绿色为活细胞，红色为死细胞）及（e）活细胞定量分析；（f）各组细胞凋亡的流式分析及（g）定量分析；（h）各组细胞划痕实验图像及（i）迁移面积定量分析；（j）各组细胞Transwell迁移实验图像及（k）迁移定量分析。

（4）SP-EVs@AST水凝胶调节线粒体稳态

SP-EVs@AST凝胶可抑制辐射诱导的ROS生成（图4a-d），并减轻线粒体膜电位下降（图4e,h）。该凝胶组还表现出更高的荧光共定位系数，表明细胞色素C释放减少、线粒体损伤较轻（图4f,i）。此外，SP-EVs@AST凝胶组的γ-H2AX荧光强度显著低于IR组，说明其能有效抑制辐射引起的DNA损伤（图4g,j）。综上，SP-EVs@AST凝胶可顺利获得抑制ROS、调节线粒体稳态并减轻DNA损伤发挥辐射防护作用。

图4 SP-EVs@AST凝胶抑制HaCaT细胞中辐射诱导的氧化应激、线粒体改变及DNA损伤。（a）各组ROS水平的代表性荧光图像及（b）荧光定量分析；（c）ROS水平的流式细胞术分析及（d）荧光定量分析；（e）使用JC-1染色显示的线粒体膜电位代表性荧光图像；（f）HaCaT细胞中线粒体细胞色素C（Cyt-C）的释放情况；（g）各组γ-H2AX染色的代表性荧光图像（蓝色为细胞核，绿色为DNA片段）；（h）JC-1比值、（i）线粒体与Cyt-C共定位系数及（j）γ-H2AX比值的定量分析。

（5）SP-EVs@AST水凝胶保护小鼠免受辐射诱导的皮肤损伤

基于体外实验中观察到的良好辐射防护效果，在辐射性皮炎小鼠模型中进一步评估了SP-EVs@AST凝胶的体内功效（图5a）。模型建立及给药方案如图5b所示。结果显示，与IR组相比，SP-EVs@AST凝胶组在第1天由辐射热引起的急性皮肤伤口显著减少；第4天其他组出现干性脱屑时，该组未见明显脱屑；第8天IR组出现明显红斑与水肿，而SP-EVs@AST凝胶组无此症状；第12天IR、Gel、SP-EVs凝胶及AST凝胶组出现广泛皮肤剥落与肿胀，其中IR组还伴有明显渗出，而SP-EVs@AST凝胶组开始脱痂，提示皮肤开始更新；至第16天，IR组出现溃烂与出血，SP-EVs@AST凝胶组则呈现皮肤恢复与新生毛发生长迹象（图5c）。在16天的观察期内，SP-EVs@AST凝胶显著延缓了辐射性皮炎的发生，加速了愈合过程，促进了皮肤更新与毛发生长。RTOG评分结果进一步支持上述观察，显示该凝胶组的皮肤损伤评分随时间显著改善（图5d）。

图5 SP-EVs@AST凝胶防止辐射诱导组织损伤。（a）动物实验示意图与时间线；（b）各组（Control, IR, Gel, AST gel, SP-EVs gel, SP-EVs@AST gel）小鼠的凝胶处理照片；（c）不同药物治疗下小鼠背部皮肤的照片记录；（d）各组小鼠随时间的RTOG评分；（e）皮肤样本的H&E染色、（f）Masson三色染色及（g）天狼星红染色的代表性图像；（h）各组小鼠背部皮肤的血流灌注情况。

（6）SP-EVs@AST水凝胶减轻异常皮肤组织学变化

H&E染色显示，在实验中期SP-EVs@AST凝胶组的表皮状况优于IR组（图S11）；实验结束时，SP-EVs@AST凝胶组表皮完整，而IR、Gel、SP-EVs凝胶及AST凝胶组均出现严重表皮损伤与溃烂（图5e）。Masson三色染色与天狼星红染色表明，SP-EVs@AST凝胶组的胶原纤维排列有序，其他组则呈现紊乱结构（图5f,g）。免疫荧光分析显示，SP-EVs@AST凝胶降低了辐射引起的I型胶原（COLI）表达升高（图6a），显著上调了表皮干细胞标志物整合素α6（Itgα6）的表达（图6b），并表现出优于IR组的细胞增殖标志物Ki67表达（图6c）。半定量分析进一步证实，该凝胶能抑制辐射引起的异常胶原沉积并保护正常细胞增殖（图6d）。

图6 SP-EVs@AST凝胶防止辐射诱导胶原沉积并恢复皮肤细胞增殖。（a-c）不同处理后小鼠背部皮肤中COLI、Itgα6及Ki67的代表性免疫荧光图像；（d）COL1、Itgα6与Ki67的半定量分析。

（7）SP-EVs@AST 水凝胶抑制氧化损伤，减轻炎症，并维持线粒体稳态

体外实验发现SP-EVs@AST凝胶能抑制辐射诱导的氧化应激，体内实验进一步验证了该作用。SP-EVs@AST凝胶处理显著降低了皮肤组织中MDA含量，同时提高了SOD和GSH-Px水平（图7a）。ELISA检测显示该凝胶降低了辐射引起的IL-6、TNF-α和IL-1β表达（图7b）；IL-6免疫组化染色结果与此一致（图7c,f）。免疫荧光分析表明SP-EVs@AST凝胶能显著上调皮肤组织中TGF-β的表达（图7d,g）。MPO表达在Control组和SP-EVs@AST凝胶组维持正常水平，而IR组则异常升高（图7e,h）。透射电镜图像显示SP-EVs@AST凝胶有效逆转了X射线辐照小鼠皮肤中线粒体嵴结构的缺失和肿胀（图7i）。

图7 SP-EVs@AST凝胶抑制辐射诱导的氧化应激、线粒体损伤及炎症。（a）皮肤样本中MDA、SOD及GSH-Px浓度的定量；（b）皮肤样本中IL-6、IL-1β及TNF-α水平的ELISA分析；（c）IL-6的代表性IHC图像及（f）其半定量分析；（d）TGF-β的代表性IF图像及（g）其半定量分析；（e）MPO的代表性IHC图像及（h）其半定量分析；（i）各组小鼠背部皮肤组织中线粒体的TEM图像。

（8）SP-EVs@AST水凝胶干预下放射性皮炎基因表达的综合分析

对第16天的Control、IR和SP-EVs@AST凝胶组小鼠皮肤样本进行RNA测序分析。组间相关性分析显示各组间一致性高，无离群样本（图8a）。差异表达分析显示，与IR组相比，SP-EVs@AST凝胶组有1173个基因存在差异表达，其中914个上调、259个下调（图8b）。GO富集分析提示这些基因显著关联于角质化包膜、脂肪酸代谢过程、胶原细胞外基质等生物学过程（图8c）。KEGG分析显示其在ECM-受体相互作用、细胞粘附分子、Th1/Th2细胞分化等通路中显著富集（图8d）。进一步基因集分析表明，SP-EVs@AST凝胶组中细胞迁移相关基因（Dab1, Adtrp, Thbs4, Enpep）上调（图8e）；胶原相关基因（COL1, COL6）表达亦升高（图8f）；角质形成细胞相关LCE基因家族表达上调（图8g）；而IR组中白细胞相关基因（Jaml, Cd177）表达升高（图8h）。结果表明SP-EVs@AST凝胶可顺利获得调控细胞迁移、胶原合成、角质形成细胞分化及炎症反应等多个关键生物学过程，综合缓解辐射性皮炎。

图8 SP-EVs@AST凝胶干预后辐射性皮炎的差异基因表达分析。（a）Control组、IR组与SP-EVs@AST凝胶组之间的基因相关性分析；（b）IR组与SP-EVs@AST凝胶组间的差异表达基因数量；（c）差异表达基因的GO富集分析与（d）KEGG富集分析；与（e）细胞迁移、（f）细胞外基质、（g）角质形成细胞及（h）白细胞相关基因集的聚类分析；（i）IR组与SP-EVs@AST凝胶组中氧化应激相关基因的差异表达（横坐标为TPM）。

（9）SP-EVs@AST 水凝胶顺利获得调控Nrf2/Keap1/HO-1/NQO1通路促进机体抗氧化功能

差异表达基因分析显示，SP-EVs@AST凝胶干预可调节Pparg、Nrf2、Keap1等氧化应激相关基因的表达（图8i），并显著调控Nrf2/Keap1/HO-1/NQO1通路（图9a）。RT-qPCR表明，与IR组相比，SP-EVs@AST凝胶处理可降低Keap1表达，增加Nrf2及其下游HO-1、NQO1的mRNA水平（图9b）。免疫荧光显示该凝胶组中Nrf2表达显著升高（图9c,d）。Western blot进一步证实凝胶处理能下调Keap1蛋白、上调Nrf2、HO-1及NQO1蛋白表达（图9e,f）。表明SP-EVs@AST凝胶主要顺利获得激活Nrf2/Keap1/HO-1/NQO1通路增强细胞抗氧化能力，进而保护线粒体免受氧化损伤。

图9 SP-EVs@AST凝胶调控Nrf2/Keap1/HO-1/NQO1通路。（a）Nrf2通路的作用机制示意图；（b）HaCaT细胞中Nrf2、HO-1及NQO1 RNA水平的RT-qPCR检测；（c）Nrf2核转位的代表性图像及（d）其平均荧光强度的柱状图；（e）HaCaT细胞中Nrf2、Keap1、HO-1与NQO1蛋白表达的Western blot图像（从左至右依次为Control组、IR组、Gel组、SP-EVs凝胶组、AST凝胶组及SP-EVs@AST凝胶组）；（f）各蛋白相对于微管蛋白相对表达的灰度值定量分析。

（10）生物安全性评估

体内实验表明，凝胶、SP-EVs凝胶、AST凝胶及SP-EVs@AST凝胶对血细胞、肝功能（AST、ALT）及肾功能（BUN）均无显著毒性（图10a）；主要器官H&E染色未见组织损伤（图10b）；皮肤组织H&E、Masson及天狼星红染色显示各组对皮肤完整性无不良影响（图10c）。结果表明SP-EVs@AST凝胶及其组分具有良好的生物相容性与安全性。

图10 生物安全性评价。（a）各组处理后小鼠的血液学与血清生化检测；（b）各组处理后小鼠主要器官的H&E染色；（c）各组处理后小鼠背部皮肤组织的H&E、Masson及天狼星红染色。