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针对上述问题，复旦大学附属肿瘤医院刘继勇团队构建了一种双载荷仿生纳米递送系统TP-siRC@tHyNPs，该系统以肺转移灶高表达的CYP3A4为靶点，先用特异性siRNA沉默该代谢酶以显著延长雷公藤甲素（TP）半衰期；再用外泌体-阳离子脂质体杂化膜（tHyNPs）共包载TP与CYP3A4-siRNA以克服裸siRNA易降解、脂质体毒性大及外泌体载药低的缺陷。另外，该纳米粒表面修饰了DR5单链抗体（scFv），可精准识别肿瘤细胞高表达而正常组织几乎缺如的DR5受体，触发死亡受体凋亡通路并增强靶向渗透。体内外实验系统评价了其理化性质、细胞摄取、代谢谱、抗肿瘤活性及生物安全性，证实该多功能平台可实现药物-基因协同、精准递送与低毒高效治疗PMM的临床潜能。该文章于2025年7月25日以《Engineering hybrid nanoparticles for targeted codelivery of triptolide and CYP3A4- siRNA against pulmonary metastatic melanoma》为题发表于《Science Advances》上（DOI: 10.1126/sciadv.adv6990）。

研究示意图

（1）DR5-scFv的构建与抗肿瘤效应表征

为取得全长人源DR5-scFv，实验经慢病毒转染的293T细胞表达取得。图2A、2D的分子对接结果显示其与DR5蛋白结合常数KD=7×10⁻⁸ M；图2B~C的CBB染色及WB结果证实了瞬时转染后DR5-scFv蛋白表达；图2E~F中稳转293T-DR5-scFv细胞的RT-qPCR、CBB染色、AGE及熔解曲线确认了基因整合与持续表达。A375M荷瘤裸鼠按图2G方案给药后，图2H~I显示DR5-scFv组肿瘤重量显著降低，肿瘤体积曲线下降（图2J）；图2K~L的H&E染色及TUNEL结果表明肿瘤组织坏死及凋亡增加。

图1 DR5-scFv的构建与抗肿瘤效应表征。A）DR5-scFv与DR5蛋白的分子对接分析；B~C）CBB染色和DR5-scFv的WB分析；D）DR5-scFv和DR5蛋白之间的亲和信号；E）5T-DR293-scFv细胞中DR5-scFv基因表达水平；F）CBB染色分析DR5-scFv；G）治疗过程的示意图；H）治疗后实体瘤的代表性图像；I）肿瘤重量；J）实验期间小鼠的肿瘤体积生长曲线；K）不同组别肿瘤组织的H&E图像；L）不同组肿瘤组织的TUNEL染色

（2）TP-siRC@tHyNPs的制备和表征

图2A TEM结果显示DR5-Exo呈囊泡状，图2B免疫电镜显示其膜表面高表达DR5-scFv；图2C表明其含有CD9/CD63/TSG101；图2D~F及图2J显示TP-siRC@Lip以DOPE为辅助脂质，呈球形，EE=86.17±5.36%，DL=9.25±0.59%，粒径135.77±2.95 nm、ζ电位近中性；图2G~H 表明CYP3A4-siRNA对A375M细胞的抑制率为51.84±6.55%，传代后表达回升；图2I显示了TP-siRC@Lip是由CYP3A4-siRNA与已包封TP的阳离子脂质体以 N/P=3:1 共孵育并顺利获得静电复合形成siRNA 脂质复合物。2K~M显示TP-siRC@tHyNPs由DR5-Exo:TP-siRC@Lip=2:1（w/w）经冻融融合制得，FRET结果证实了其膜的成功融合；图2N~P的免疫电镜与WB结果表明其保留外泌体标志物及DR5-scFv。图2Q~R表明在pH 5.5时，其4 h累积释放率为79.46±4.14%，血浆、储存及稀释稳定性良好。

图2 TP-siRC@tHyNPs的制备和表征。A~B）DR5-Exo的TEM图和免疫电子显微镜图像；C）DR5-Exo和Exo的WB分析；D）Lip的透射电镜；E）TP@Lip的透射电镜；F）药物血脂比对TP@Lip EE%和DL%的影响；G）用靶向CYP3A4的不同siRNA序列处理的细胞中CYP3A4蛋白表达的WB分析；H）正常A3M细胞、siRNA-CYP4A375处理细胞和siRNA-CYP3A4处理后传代细胞中CYP3A4蛋白表达的WB分析；I）不同N/P比制备的TP-siRC@Lip的AGE结果；J）TP-siRC@Lip的透射电镜；K）TP-siRC@tHyNPs制备示意图；L）以不同DR5-Exo与TP-siRC@Lip比制备的TP-siRC@tHyNPs的Zeta电位；M）FRET确认TP-siRC@Lip和DR5-Exo之间的融合；P）TP-siRC@tHyNPs和TP-siRC@HyNPs中特征蛋白的WB分析；Q）TP-siRC@tHyNPs在pH 5.5和pH 7.4下的药物释放曲线；R）TP-siRC@tHyNPs的血浆稳定性分析（24 h）

（3）细胞内摄取、分布和代谢分析

图3A的结果表明TP-siRC@Lip主要定位于核周（红色）；图3B显示DR5-Exo与 Exo呈绿色核周分布且DR5-Exo荧光强度更高，而PKH67-DiD共定位黄色证实膜的成功融合，DAPI叠加后TP-siRC@tHyNPs的DiD信号显著高于TP-siRC@HyNPs，证实了DR5功能化可提升递送效率；图3C线粒体共定位分析表明TP-siRC@tHyNPs与线粒体高度重叠；图3D的流式细胞术结果显示细胞4 h摄取达峰并于 6 h 下降；此外，图3E细胞药物浓度-时间曲线和相关药代动力学参数如表明，游离药物组的TP在细胞内快速代谢，半衰期为1.71±0.45小时。与CYP3A4-siRNA（TP&siRC@HyNPs，用Exo和siRC@Lip制备的TP和siRC@HyNPs的混合物）共同给药，TP半衰期显著延长，达到5.08±0.51小时，增加了2.97倍。

图3 细胞内摄取、分布和代谢分析。A）荧光标记的TP-siRC@Lip，Exo和DR5-Exo在A375M细胞中的细胞内分；B）TP-siRC@HyNPs和TP-siRC@tHyNPs在A375M细胞中的细胞内分布；C）不同处理组脂质体（红色）和Exo（绿色）的定量荧光强度分析；D）流式细胞术分析用TP-siRC@tHyNPs处理的A375M细胞在不同时间点的细胞内荧光强度；E）不同处理组TP在A375M细胞中的药物浓度-时间曲线

（4）体外抗肿瘤活性评估

图4A~B结果表明，TP-siRC@tHyNPs使A375M细胞存活率降至最低，抑制率呈浓度依赖，显著优于TP、TP&siRC@HyNPs及TP-siRC@HyNPs；图4C~G显示3 TP-siRC@tHyNPs在3D球体模型中诱导的凋亡荧光最强；图4D~H流式检测结果显示TP-siRC@tHyNPs组凋亡率为82.69 ± 2.48 %，显著高于TP-siRC@HyNPs（58.31±4.02 %）和TP-siRC@Lip（44.57±3.55 %）；图4E~I的Transwell侵袭实验结果表明，在24 h后，TP-siRC@tHyNPs组穿膜细胞数减少，侵袭抑制率21.78±3.16 %，优于TP-siRC@HyNPs（13.44±2.31 %）。显示其侵袭抑制率为21.78 ± 3.16 %；图4F~J的划痕实验结果表明，TP-siRC@tHyNPs组在12 h迁移距离缩短，迁移抑制率13.83±5.41 %，较TP-siRC@HyNPs（7.92±2.11 %）和TP-siRC@Lip（5.36±1.88 %）显著增强。综合表明TP-siRC@tHyNPs顺利获得DR5靶向、CYP3A4沉默与TP协同，显著抑制PMM细胞增殖、诱导凋亡并阻断侵袭迁移。

图4 体外抗肿瘤活性评估。A) A375M细胞暴露于不同治疗组24 h后的活力；B）用TP，TP&siRC@HyNPs，TP-siRC@HyNPs和TP-siRC@tHyNPs处理的A375M细胞的细胞活力，TP浓度为50ng / ml；C）经过不同处理的3D肿瘤球体模型中的细胞凋亡测定；D）流式细胞术分析不同处理后A375M细胞凋亡；E）Transwell测定法对不同组别A375M细胞的抗侵袭作用；F）不同处理的A375M细胞的细胞迁移测定；G）3D肿瘤球体的定量荧光强度分析；H~J）定量分析不同治疗组中A375M细胞的细胞凋亡百分比、侵袭率和迁移率

（5）体外潜在抗肿瘤机制的研究

TP-siRC@tHyNPs表现出显著的抗肿瘤作用。图5A~B中HMGB1、CRT的暴露及ATP释放的增加，提示诱导 ICD；图5C~D中CD86荧光强度的升高，及CD206降低，表明巨噬细胞由M2向M1极化；图5E流式细胞周期分析表明S期细胞比例由21 %增至53 %，G2/M 期由18 %降至9 %，呈现典型 S 期阻滞；；图5F Western blot结果显示，TP-siRC@tHyNPs处理后M1型巨噬细胞标志p-STAT1、CD86、TNF-α和IL-6表达上调，M2型标志CD206和Arg-1表达下调；凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、-8、-9、Bid、Bax及胞质Cyto-c显著升高，Bcl-2与NF-κB明显降低；survivin和VEGF水平分别下降60%与64%，p-JAK2和p-STAT3磷酸化水平下降58%与62%。综上表明TP-siRC@tHyNPs可顺利获得同时激活外源-线粒体双途径凋亡、阻断JAK2/STAT3通路并诱导巨噬细胞M1极化，协同抑制黑色素瘤细胞存活与血管生成。

图5 体外潜在抗肿瘤机制的研究。A）CLSM图像显示不同处理的A375M细胞中的CRT暴露；B）A375M细胞中HMGB375的CLSM图像；C）不同处理BMDCs中CD80+和CD86+细胞的FCM分析；D）不同处理的M2巨噬细胞标志物CD206+F4/80+表达的FCM分析；E）不同组的细胞周期分布；F）A375M细胞中细胞凋亡相关蛋白表达的WB分析

（6）TP-siRC@tHyNPs的体内药代动力学和生物分布

使用小动物活体成像系统在体内监测TP-siRC@Lip，TP-siRC@HyNPs和TP-siRC@tHyNPs的纵向动态分布。图6A显示了荧光信号强度随时间的变化情况。TP-siRC@Lip组注射后1 h肺部荧光几乎检测不到。相比之下，TP-siRC@HyNPs和TP-siRC@tHyNPs在10分钟时在肿瘤和肿瘤周围区域都显示出峰值荧光积累，且保留时间长达12 h。值得注意的是，TP-siRC@tHyNPs组表现出更高的荧光强度，表明肿瘤选择性增强并保留时间延长。此外，图6B-C器官的荧光成像结果表明注射后12 h，TP-siRC@tHyNPs组在肺部仍表现出最高的荧光积累；图6D为游离TP、TP&siRC@HyNPs、TP-siRC@HyNPs和TP-siRC@tHyNPs组的血浆浓度-时间曲线。经分析可知，与游离TP相比，TP&siRC@HyNPs组TP的半衰期增加了1.2倍（t1/2= 0.16 ± 0.01 h），表明CYP3A4-siRNA能有效抑制TP代谢，显着延长其生物半衰期；图7E提示TP-siRC@tHyNPs在肺（肿瘤）的TP浓度始终最高，10 min达峰后维持高浓度至12 h；非靶组织浓度最低，提示其具有选择性靶向性及持续释放能力。

图6 TP-siRC@tHyNPs的体内药代动力学和生物分布。A）在特定时间间隔内对接受TP-siRc@Lip、TP-siRC@HyNPs和TP- siRc@tHyNPs治疗的患有肺转移性黑色素瘤的小鼠的荧光成像图；B）给药后12 h后分离组织的体外荧光图像；C）组织中荧光强度的定量分析；D）TP、TP&siRC@HyNPs、TP-siRC@HyNPs和TP-siRC@tHyNPs的血浆药物浓度-时间曲线；E）在预定的给药后时间点肺组织中的TP浓度

（7）TP-siRC@tHyNPs体内抗PMM作用

接着，实验顺利获得建立两种荷瘤小鼠模型研究了TP-siRC@tHyNPs对PMM的体内疗效。顺利获得建立两种荷瘤小鼠模型研究了 TP-siRC@tHyNPs 对 PMM 的体内疗效。在最初的黑色素瘤肺转移模型中，图7A为小鼠接受7剂治疗，然后实施安乐死，并收集其肺进行Bouin染色（图7B）的示意图；由图7C~D H&E分析可知，对照组显示广泛的肿瘤结节，具有簇状肿块或索状结构（用箭头表示），边界明显，细胞核扩大和肺泡受压。相比之下，TP-siRC@tHyNPs治疗导致肿瘤结节面积大幅减少，肺泡结构正常。肺组织的Ki67染色（图7E）进一步证明了TP和DR5-scFv的组合显著抑制了肿瘤增殖。此外，图7F的免疫组化（IHC）结果显示TP组和TP&CYP3A4-siRNA组的裂解caspase 3表达增加，其中TP-siRC@tHyNPs组的信号最强；图7G的TUNEL染色结果证实了这一趋势，显示TP-siRC@tHyNPs组的细胞凋亡率最高（80.34 ± 3.57%）。另外，CRT暴露分析进一步表明，TP在体内诱导ICD，并顺利获得CYP3A4-siRNA共递送和肿瘤靶向积累增强ICD（图7H）；图7I结果表明，其他组相比，TP-siRC@tHyNPs组的转移性结节总数（TNMN）显着减少图7J的Kaplan-Meier生存曲线显示TP-siRC@tHyNPs治疗组具有显著的生存优势。这些发现表明，CYP3A4-siRNA增强了TP的抗PMM作用，并且TP和DR5-scFv发挥了协同的肿瘤抑制作用。

图7 TP-siRC@tHyNPs体内抗PMM作用。A）给药时间表的示意图；B）不同处理后的肺组织的代表性图像；C）肺切片的H&E染色；D）在高放大倍率下局部肺切片的放大视图；E）肺组织切片的Ki67染色；F）不同组中裂解的caspase 3表达；G）不同治疗组的肺组织中的凋亡细胞的TUNEL测定；H）不同组肺切片的CRT免疫染色I）不同治疗组肺部TNMN的定量；J）荷瘤小鼠的生存曲线

（8）TP-siRC@tHyNPs的体内抗PDX功效

此外，实验使用患者来源的异种移植（PDX）模型来评估TP-siRC@tHyNPs对肺转移性肿瘤的抑制作用（图8A）。图8B~E为治疗后收集的肿瘤体积、重量和抑制率数据，结果表明游离TP和DR5-scFv均能有效抑制肿瘤生长。另外值得注意的是，该研究顺利获得仿生系统的共同递送进一步增强了这种效果，其中TP-siRC@tHyNPs表现出最显着的抑制作用。此外，图8F结果表明，相比于其他组，TP-siRC@tHyNPs组的PDX小鼠的生存期显著延长；图8G~H的肿瘤组织的H&E和TUNEL染色结果显示治疗组存在广泛的坏死和广泛的细胞凋亡。图8I为裂解的caspase 3的IHC染色结果，分析表明，与对照组相比，TP和DR5-scFv修饰的细胞凋亡信号siRC@tHyNPs升高，其中TP-siRC@tHyNPs组显示出最高比例的裂解caspase 3阳性细胞，同时Ki67表达的免疫荧光分析（图8J）进一步支持了这一趋势。此外，图8K的CRT染色结果显示TP诱导了显著的表面CRT暴露，表明其具有ICD诱导潜力，同时实验顺利获得siRC@tHyNPs系统共同递送进一步增强了ICD诱导潜力。

图8 TP-siRC@tHyNPs的体内抗PDX功效。A）给药时间表示意图；B） PBS、siRC@tHyNPs、TP和TP-siRC@tHyNPs组的肿瘤的代表性图像；C）实验期间的肿瘤体积生长曲线；D）不同组切除肿瘤的重量；E）治疗组肿瘤生长抑制率；F）不同治疗下携带PDX肿瘤的小鼠的生存曲线；G）不同组肿瘤切片的H&E测定图像；H~I）不同组的 TUNEL染色和裂解的caspase 3表达；J）肿瘤组织切片的Ki67免疫标记；K）不同组肿瘤切片的CRT免疫染色