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针对上述问题，上海交通大学医学院附属第九人民医院Fu Jingke、赵杰团队在雄性RA小鼠模型中，将天然微生物钝顶螺旋藻（Spirulina platensis，SP）作为滑膜炎症和破骨细胞分化的调节剂。SP可减少滑膜巨噬细胞中过量的活性氧，下调促炎性细胞因子，并使促炎性M1样巨噬细胞重编程为抗炎性M2样表型，抑制滑膜炎并重塑氧化还原平衡（图1A）。SP还能有效抑制破骨细胞的活化，阻断骨侵蚀的进展。将SP包裹于巨噬细胞膜形成仿生纳米系统（SP@M），使其具有免疫逃逸与滑膜定位能力。机制上，SP@M可增强LC3介导的自噬，促进KEAP1的降解与NRF2的激活，上调SOD2、HO-1等抗氧化蛋白，阻断ROS引发的级联炎症反应，从而抑制巨噬细胞炎性激活，减轻骨破坏，为RA的系统性干预给予有效策略。该文章于2025年5月13日以《Engineered Spirulina platensis for treating rheumatoid arthritis and restoring bone homeostasis 》为题发表于《Nature Communications》（DOI: 10.1038/s41467-025-59579-4）。 

（1）SP顺利获得巨噬细胞的炎症调节恢复滑膜内稳态

钝顶螺旋藻（SP）是具有天然螺旋形态的原核光合微生物，长度100 - 500μm（图1B、C）。SP中叶绿素的自发荧光使其具有强烈红色荧光（图1D），表明其在生物成像中有潜在应用。SP的UV - vis吸收光谱在440和680 nm附近有明显吸收，源于其细胞内丰富的叶绿素（图1E），620 nm附近的宽吸收带则为SP中特异性藻蓝蛋白所致。

图1 基于螺旋藻（SP）的治疗剂对类风湿性关节炎（RA）骨稳态重塑的机制。（A）巨噬细胞膜工程化SP（SP@M）靶向递送示意图，SP@M顺利获得减轻滑膜炎症和独立抑制破骨细胞活化重塑RA骨稳态，SP经LC3介导的自噬和泛素介导的蛋白酶体降解加速KEAP1蛋白降解，KEAP1失活后NRF2核转位增加，减轻CIA小鼠模型滑膜炎症和改善RA；（B）SP细胞明视野显微镜图像；（C）SP细胞扫描电镜图像；（D）SP细胞荧光图像；（E）SP细胞紫外-可见吸收光谱

LPS 刺激导致 RAW264.7 细胞内 ROS 过度产生并出现明显绿色荧光，而 SP 处理后细胞荧光强度显著降低且呈剂量依赖性（图 2A，B）。RT-qPCR 分析表明，LPS 刺激使 RAW264.7 细胞中促炎细胞因子 mRNA 表达显著上调，SP 治疗则使其呈剂量依赖性下调，证实 SP 具有抗炎作用（图 2C）。SP 处理还呈剂量依赖性降低 M1 样巨噬细胞比例，增加 M2 样巨噬细胞比例，抑制促炎 M1 样巨噬细胞极化，促进抗炎 M2 样巨噬细胞分化（图 2D-F）。此外，RT-qPCR 分析显示，SP 处理组中 M2 样巨噬细胞标志物 CD206、IL-10、Arg-1 的 mRNA 表达显著上调（图 2G）。综上，SP 可调节氧化应激，促进巨噬细胞向抗炎表型重编程，有助于缓解 RA 特定环境下的炎症，维持滑膜稳态。

图2 SP顺利获得减轻巨噬细胞的氧化应激和炎症调节来恢复滑膜稳态。（A）不同浓度SP和脂多糖刺激巨噬细胞24 h后，分析巨噬细胞内DCFH-DA的荧光光谱；（B）图A中DCFH-DA相对荧光强度的定量；（C）实时荧光定量PCR分析LPS和不同浓度SP刺激24 h后巨噬细胞中TNF-α、iNOS、IL-1、IL-6和IL-12的表达；（D）流式细胞术检测LPS和不同浓度SP刺激24 h后巨噬细胞CD 86表达变化；（E）流式细胞术检测白细胞介素-4（20 ng/mL）和不同浓度SP刺激巨噬细胞24 h后CD 206和CD 11b的表达；（F）图D和E中CD 86或CD 206标记阳性细胞的定量；（G）RT-qPCR分析IL-4和不同浓度SP刺激巨噬细胞24 h后CD 206、IL-10和Arg-1的表达

（2）SP顺利获得抑制破骨细胞活化阻断骨侵蚀的进展

如图3A、图3B所示，RANKL诱导的Bcl 4具有明显骨诱导特征，包括更多TRAP染色阳性细胞和F-肌动蛋白染色成熟破骨细胞形成。而SP处理后，TRAP阳性细胞数量和面积以及破骨细胞平均面积均显著减少，呈剂量依赖性，表明SP抑制破骨细胞分化。图3C显示SP处理下调RANKL诱导的BcR中NFATc 1、c-Fos和CTSK基因表达。图3D、E表明SP处理后，这些蛋白在0、1、3、5天水平均受抑制。图3F、G显示SP阻断NF-κB信号通路中P65及MAPK信号通路中ERK和P38的磷酸化。图3H、I显示SP抑制P65和P38蛋白磷酸化及在RANKL诱导的BclB中P38和P65蛋白易位。总之，SP有效阻止破骨细胞分化，恢复骨平衡，减轻RA骨侵蚀。

图3 SP顺利获得抑制破骨细胞活化阻断骨侵蚀进展。（a）用M-CSF和RANKL刺激BMM，再用不同剂量SP处理5d，进行TRAP染色和F-actin荧光染色；（b）定量图a中TRAP染色破骨细胞数量、面积及F-actin带面积；（c）用M-CSF和RANKL刺激BMM后，SP处理5d的Nfatc1、C-fos和Ctsk的RT-qPCR分析；（d）用M-CSF和RANKL刺激后，SP处理BMM的NFATc1、c-Fos和Ctsk的WB分析；（e）图d中NFATc1、c-Fos和Ctsk灰度值的半定量；（f）用M-CSF和RANKL刺激后，SP处理BMM的磷酸化-P38、P38、p-ERK、ERK、IκBα、p-P65和P65的WB分析；（g）图f中p-P38/P38、p-ERK/ERK、IκBα和p-P65/P65灰度值的半定量；（h）用M-CSF和RANKL刺激后，SP处理BMM的p-P38和p-P65免疫荧光分析；（i）图h中p-P38和p-P65的IOD/DAPI定量

（3）SP顺利获得NRF 2/KEAP 1信号通路重建体外骨稳态

如图4A、B所示，SP在巨噬细胞中上调SOD2、HO-1、NRF2、GPX1和GPX4表达，剂量依赖性下调KEAP1。图4C、D显示，SP抑制KEAP1，同时增加RANKL刺激破骨细胞中上述蛋白表达。图4E表明，研究者用CHX、MG132和Chlq探索巨噬细胞中潜在机制。图4F、G显示，SP促进KEAP1蛋白降解，且该过程可被MG132阻碍，表明KEAP1降解依赖蛋白酶体途径。图4H显示，KEAP1多泛素化水平随SP剂量增加，证实SP增强KEAP1泛素化修饰。图4I、J显示，Chlq可阻断SP介导的KEAP1降解，表明自噬途径也参与其中。图4K、L显示，SP降低KEAP1平均荧光强度，剂量依赖性增加KEAP1与阿糖胞苷共定位。图4M、N显示，SP增强LC3平均荧光强度，促进LC3与KEAP1共定位。这些结果表明SP促进自噬体对KEAP1的吞噬。

图4 体外SP顺利获得NRF2/KEAP1信号通路重塑骨稳态。（A）不同剂量SP刺激巨噬细胞的SOD2、HO-1、NRF2、GPX1、GPX4和KEAP1的WB分析；（B）图A中SOD2、HO-1、NRF2和KEAP1灰度值的半定量；（C）用M-CSF、RANKL和SP刺激24 h的BMM的SOD2、HO-1、NRF2、GPX1、GPX4和KEAP1的WB分析；（D）图C中SOD2、HO-1、NRF2和KEAP1灰度值的半定量；（E）KEAP1蛋白降解试验示意图；（F）不同剂量SP、CHX和MG132刺激巨噬细胞8 h后HO-1、NRF2、KEAP1和GPX4的WB分析；（G）图F中NRF2和KEAP1灰度值的半量化；（H）用MG132（10μM）和不同剂量SP处理的293T细胞，HA-KEAP1和Myc-泛素质粒与HA标记珠子进行KEAP1的HUbiquitylation分析；（I）不同剂量SP、CHX和Chlq刺激8 h的巨噬细胞中HO-1、NRF2、KEAP1和GPX4的WB分析；（J）图I中NRF2和KEAP1灰度值的半定量；（K）不同剂量SP刺激24 h后巨噬细胞KEAP1和泛素的免疫荧光分析；（L）定量图K中KEAP1的平均荧光强度和融合颜色；（M）不同剂量SP刺激巨噬细胞24 h后KEAP1和LC3的免疫荧光分析；（N）定量图M中KEAP1、LC3的平均荧光强度和合并颜色

（4）SP @M的制备及其对CIA小鼠踝关节炎的靶向治疗

顺利获得低渗裂解、均质挤出、梯度离心和低温超声处理从RAW 264.7细胞中分离得到MCM（图5A）。SP经搅拌处理后片段化，长度为5 – 100 μm，其自发荧光和活力保持良好（图5B、C）。将片段化SP过滤后，与MCMs共挤出，制得SP@M。透射电镜观察显示，SP@M表面部分被巨噬细胞膜修饰（图5D、E）。考马斯亮蓝染色分析表明，MCMs蛋白成功易位到SP@M上（图5F）。SDS - PAGE分析显示，SP@M中保留了MCMs的重要蛋白条带，如TNFR2（50kDa）、CCR2α（35kDa）和CD36（36kDa）（图5G）。在CIA小鼠模型中，SP@M组在0.5小时内爪中即检测到荧光信号，且24小时后信号仍强烈，而SP组爪部荧光信号较弱（图5H、I）。

图5 MCMs - 工程化SP（SP@M）的制备、表征及其对CIA小鼠炎症踝关节的靶向递送。（A）SP@M准备过程的示意图；（B、C）SP@M的明场和荧光显微镜图像；（D、E）SP（D）和SP@M（E）的透射电镜图像；（F）用SDS - PAGE和考马斯亮蓝染色分析SP、MCMs和SP@M的蛋白质组成；（G）SP、MCMs和SP@M组TNFR2、CCR2α和CD36的WB分析；（H）静脉内给予Cy5标记SP或Cy5标记SP@M后CIA小鼠的体内荧光成像；（I）爪部活体荧光信号的时间依赖性定量数据，以及24 h时四肢等组织荧光信号的定量数据

（5）SP@M可实现体内滑膜稳态、骨恢复和软骨保护

在CIA小鼠模型中研究了SP和SP@M的体内治疗效率（图6A）。CIA小鼠爪部出现严重肿胀和红斑（图6B）。随着时间推移，生理盐水组爪肿胀厚度增加（图6B、C），而MCMs和SP对爪肿胀无明显改善。SP@M显著改善爪肿胀，效果优于MTX。顺利获得显微计算机断层扫描分析骨侵蚀率（图6D），SP@M显著抑制骨侵蚀，优于MTX组，且侵蚀指数定量分析显示SP@M处理骨侵蚀恢复效果最好（图6E）。SP@M处理后距骨骨水平的骨体积/总体积（BV/TV）显著更高，表明其改善RA诱导的骨降解效果更好。SP@M和MTX治疗可减轻小鼠下肢疼痛，增加疼痛反射的阈值和潜伏期（图6F）。组织病理学分析显示，生理盐水组踝关节组织有广泛炎性细胞浸润、滑膜增生、骨侵蚀和软骨破坏（图6G、H），而SP@M治疗显著减少滑膜炎，减轻滑膜中SM浸润，恢复骨表面侵蚀、距骨破坏和关节软骨变性，且SP@M组炎性区域中破骨细胞数量显著减少（图6G、I）。免疫组织化学分析显示，生理盐水组TNF-α表达显著升高，而SP@M治疗后TNF-α标记的阳性细胞显著减少（图6J、K）。

图6 SP@M能够在体内实现滑膜稳态、骨恢复和软骨保护。（A）CIA小鼠模型和相关治疗策略的方案；（B）图A所示小鼠右下肢的大体照片；（C）图A中所示小鼠的平均爪厚度和临床评分的定量；（D）图A所示小鼠右踝关节和聚焦距骨的三维微计算机断层扫描分析；（E）图C所示小鼠距骨的侵蚀指数和骨体积/总体积（BV/TV）的定量；（F）图A所示的小鼠在机械和热疼痛相关反应实验中阈值的定量；（G）图A中所示小鼠踝关节聚焦区域的HE染色、TRAP染色和SO/FG染色；（H）图G所示小鼠石蜡切片“SMASH”评分的定量；（I）定量图G所示小鼠石蜡切片中TRAP阳性破骨细胞的数目；（J）图A所示小鼠踝关节病灶区域TNF-α的免疫组织化学染色；（K）图J所示小鼠踝关节中TNF-α的相对积分光密度（IOD）值的定量

KEGG分析（图7B）和GSEA（图7C）显示氧化磷酸化富集，证实SP@M处理后的氧化还原调节。KEGG分析（图7B）还显示破骨细胞分化信号通路参与，与SP@M抑制单核破骨细胞分化一致。GO分析显示“免疫系统过程”“炎症反应”和“MAP激酶活性的负调节”参与生物学过程（图7A）。SP@M治疗后，氧化应激、炎症反应和破骨细胞分化得到调节，恢复骨免疫稳态，缓解RA。与生理盐水组相比，SP@M可抑制上调的KEAP1信号强度，恢复降低的NRF2信号强度（图7D、E）。免疫荧光分析显示，SP@M调节泛素与KEAP1的共定位，且SP@M处理后LC3与KEAP1的相互作用增加（图7F），与体外结果一致。

图7 SP@M顺利获得NRF2/KEAP1信号通路在体内恢复CIA小鼠模型的骨免疫稳态。（A）生理盐水组和SP@M组的生物学过程基因本体（GO）分析；（B）生理盐水组和SP@M组的Kyoto基因和基因组百科全书（KEGG）分析；（C）生理盐水组和SP@M组氧化磷酸化信号通路的基因集富集分析（GSEA）；（D）免疫荧光法检测RA小鼠踝关节石蜡切片病灶区KEAP1和NRF2的表达；（E）KEAP1和NRF2的积分光密度（IOD）/DAPI定量，如图D所示；（F）免疫荧光法检测RA小鼠踝关节石蜡切片病灶区KEAP1、泛素、LC3的表达；（G）SP@M顺利获得调节巨噬细胞和破骨细胞来抑制滑膜炎症和破骨细胞分化，从而在体内拮抗RA小鼠关节炎性反应，保护骨组织，恢复关节软骨